中華民國 102 年 4 月16 日環署檢字第 1020030348 號公告_自中華民國 102 年 6 月 15 日生效 NIEA E204.55B
【一、方法概要】
本方法係用以檢測能在胰化蛋白腖葡萄糖抽出物培養基(Tryptone glucose extract agar; TGEA)或在培養皿計數培養基(Plate count agar; PCA)中生長並形成菌落之水中好氧及兼性厭氧異營菌。
【二、適用範圍】
本方法適用於飲用水及地面水體、地下水體、廢水、污水、放流水之總菌落數檢驗。
【三、干擾】
(一) 水樣中含有抑制或促進細菌生長的物質。
(二) 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌生長物質。
【四、設備及材料】
(一) 量筒:100 至 1000 mL 之量筒。
(二) 吸管:有 0.1 mL 刻度之 1 及 10 mL 無菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管,或無菌微量吸管(Micropipet)。
(三) 培養皿:大小約 90 × 15 mm 之無菌玻璃培養皿或無菌塑膠培養皿。
(四) 稀釋瓶:100 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。
(五) 錐形瓶:200 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。
(六) 採樣容器:容量 120 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠有蓋容器,或市售無菌袋。
(七) 冰箱:溫度能保持在 4 ± 2℃。
(八) 水浴槽:溫度能保持在 45 至 50℃,且具有水循環裝置。
(九) 培養箱:溫度能保持在 35 ± 1℃。
(十) 高壓滅菌釜:溫度能保持在 121℃(壓力約 15 lb/in2 或 1.05 kg/cm2)、15 分鐘以上。
(十一)高溫乾熱烘箱:如用於玻璃器皿等用具之滅菌,溫度須能保持在 170 ± 10℃ 達 2 小時以上。
(十二)菌落計數器:用於菌落之計算。
(十三)天平:待測物重量大於 2 g 時,須能精秤至 0.01 g;待測物重量不大於 2 g 時,須能精秤至 0.001 g。
(十四)無菌操作檯:正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯(Class II 生物安全櫃)。
(十五)pH 計:精確度達 0.1 pH 單位。用於內含瓊脂培養基之 pH 值測定時,應搭配表面電極(Surface probe)。
【五、試劑】
本方法所使用的化學藥品須為試藥級以上,培養基為微生物級製品。
(一) 試劑水:導電度在 25℃ 時小於 2 μmho/cm(μS/cm)。
(二) 培養基:可選取下列二者之一。依下列配方配製培養基,或使用市售商品化的培養基均可。
- 胰化蛋白腖葡萄糖抽出物培養基(Tryptone glucose extract agar; TGEA)
葡萄糖(Glucose) 1.0 g
胰化蛋白腖(Tryptone) 5.0 g
牛肉抽出物(Beef extract) 3.0 g
瓊脂(Agar) 12.0 g 至 15.0 g
試劑水 1 L
經 121℃ 滅菌 15 分鐘。置於 45 至 50℃ 的水浴槽中,存放不超過 3 小時。培養基滅菌後若凝固,可保存於 4 ± 2 ℃,保存期限為 14 天,只可再融化一次使用。可根據檢驗需求量,依配方比例配製培養基。 - 培養皿計數培養基(Plate count agar; PCA)
葡萄糖(Glucose) 1.0 g
胰化蛋白腖(Tryptone) 5.0 g
酵母抽出物(Yeast extract) 2.5 g
瓊脂(Agar) 15.0 g
試劑水 1 L
經 121℃ 滅菌 15 分鐘。置於 45 至 50℃ 的水浴槽中,不可存放超過 3 小時。培養基滅菌後若凝固,可保存於 4 ± 2 ℃,保存期限為 14 天,只可再融化一次使用。可根據檢驗需求量,依配方比例配製培養基。
(三) 無菌稀釋液
- 磷酸二氫鉀儲備溶液
取 3.4 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶於 50 mL 之試劑水中,俟完全溶解後,以 1 N 之氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 7.2 ± 0.1。然後加試劑水至全量為 100 mL,滅菌(過濾滅菌或 121 ℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上)後,儲存於冰箱中備用。4 ± 2 ℃ 下保存期限為 6 個月(註 1)。可根據檢測需求量,依比例配製。 - 氯化鎂儲備溶液
取 8.1 g 六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)或 3.8 g 無水氯化鎂,先溶於少量試劑水中,俟完全溶解後,再加試劑水至全量為 100 mL,滅菌(過濾滅菌或 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上)後,儲存於冰箱中備用。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月(註1)。可根據檢測需求量,依比例配製。 - 無菌稀釋液
分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀儲備溶液再加入試劑水至全量為 2000 mL,混搖均勻後,分裝於稀釋瓶中,經 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上,作為無菌稀釋液備用。如欲用於水樣稀釋,分裝之無菌稀釋液滅菌後體積須為 90 ± 2.0 mL。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月(註 1)。可根據檢測需求量,依比例配製。
【六、採樣與保存】
(一) 盛裝水樣檢驗微生物時,應使用清潔並經滅菌之玻璃瓶、無菌塑膠容器或市售無菌採樣袋,且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有餘氯時,應使用內含硫代硫酸鈉錠劑之無菌採樣袋,或於無菌容器中加入適量之無菌硫代硫酸鈉以中和餘氯(採取加氯之廢水時,每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 15 mg/L。採取含氯之飲用水水樣時,每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 3% 硫代硫酸鈉,可中和之餘氯量約為 5mg/L)。
(二) 飲用水採樣前應清潔手部,出水口以火烤或以 70% 至 75% 酒精消毒。所採水樣須具有代表性。
(三) 運送時水樣溫度應維持在小於 10℃ 且不得凍結,實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2℃。
(四) 水樣應於採樣後 24 小時內完成混合稀釋步驟(七、步驟(五)),並置入培養箱中培養。
(五) 水樣量須以能做完所需檢驗為度,但不得少於 100 mL。
【七、步驟】
(一) 將已滅菌之培養基放入水浴槽內,溫度保持在 45 至 50℃,以避免凝結。
(二) 水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上,以使樣品充分混搖均勻。
(三) 視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟,使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻,而後自 10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之 100、1000、10000 倍等稀釋水樣並混搖均勻。進行稀釋步驟時,均需更換無菌吸管。稀釋方法如圖 1 所示(註2)。
(四) 以 1 mL 無菌吸管或微量吸管吸取 1 mL 的原液及(或)各稀釋度水樣滴在培養皿內。原液及(或)各稀釋度水樣均需進行二重複。
(五) 將溫度介於 45 至 50℃ 之培養基分裝至含原液及(或)各稀釋度水樣的培養皿中(厚度約 2 至 4 mm),混搖均勻後靜置凝結。
(六) 倒置培養皿於培養箱內,在 35 ± 1℃ 培養 48 ± 3 小時(註 3)。
(七) 計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之,若菌落太多造成計數困難時,則以「菌落太多無法計數」(Too numerous to count;
TNTC)表示。但若各稀釋度培養皿之菌落數均超過 300 個,則不可記錄「菌落太多無法計數」,應選取最接近 300 個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿進行菌落計數。
(八) 步驟(三)至(五)須在無菌操作檯內操作。
【八、結果處理】
(一) 若原液及各稀釋水樣中,僅有一個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 30 至 300 個之間,則選取該稀釋度之兩個培養皿,以下列公式計算總菌落數,單位為 CFU/mL(Colony forming units/mL):
- 總菌落數(CFU / mL)= 選取培養皿之菌落數總和 / 選取培養皿之水樣實際體積總和
總菌落數(CFU / mL)= X+Y /(1.0 / D)(1.0 / D) - 註:D:選取培養皿之稀釋度
X、Y:D 稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(二) 若結果與八、(一)所述不符,則以下列方式計算總菌落數:
- 若原液及各稀釋水樣中,僅有一個稀釋度的一個培養皿之菌落數在 30 至 300 個之間,則選取該稀釋度之兩個培養皿,以上述 八、(一)公式計算。
- 若原液培養皿中均無菌落生長,則總菌落數以「<1 CFU/mL」表示。若各培養皿之菌落數均小於 30 個,則選取菌落數最接近 30 個之同一稀釋度的兩個培養皿,以上述八、(一)公式計算。
- 若各培養皿之菌落數均不在 30 至 300 個之間,則選取菌落數最接近 300 個之同一稀釋度的兩個培養皿,以上述 八、(一)公式計算。
- 若有兩個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 30 至 300 個之間,或兩個稀釋度各有 1 個培養皿之菌落數在 30 至 300 個之間,則選取兩個稀釋度共 4 個培養皿,以下列公式計算:
- 總菌落數(CFU/mL)= 選取培養皿之水樣實際體積總和 / 選取培養皿之菌落數總和
總菌落數(CFU/mL)= X1+X1+X2+Y2 /(1.0 /D1)+(1.0 /D1)+(1.0 /D2)+(1.0 /D2) - 註:D1、D2:選取培養皿之稀釋度
X1、Y1:D1 稀釋度的兩個培養皿之菌落數
X2、Y2:D2 稀釋度的兩個培養皿之菌落數
(三) 數據表示:若計算所得之總菌落數小於 1(含 0),以「<1 CFU/mL」表示;總菌落數小於 100 時,以整數表示(小數位數四捨五入),
總菌落數為 100 以上時,只取兩位有效數字(四捨五入)。
(四) 檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度原始數據等相關資料。
【九、品質管制】
(一) 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
(二) 每批次採樣時,應進行運送空白。
(三) 每 10 個樣品應執行1 個方法空白樣品分析,若每批次樣品數少於 10 個,則每批次仍應執行 1 個方法空白樣品分析。
(四) 用於結果計算之二重複數據,其對數差異值不可超出精密度管制參考範圍(計算方式參考「環境微生物檢測通則—細菌(NIEA E101)」),除非二重複之菌落數均小於 20。
(五) 新購入之培養基,每批號均須進行培養基品質測試(測試方式詳見「環境微生物檢測通則—細菌(NIEA E101)」)。
(六) 本方法培養所得之細菌可能具有感染性,檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理。
【十、精密度及準確度】
略
【十一、參考資料】
American Public Health Association, American Water Works Association & Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd ed., Method 9215B, APHA, Washington, D. C., USA, 2012.
- 註1:溶液如出現異物或混濁,則不可繼續使用。
- 註2:水樣如須稀釋,建議於稀釋後 30 分鐘內完成檢測步驟,以免造成細菌死亡或增生,影響實驗結果。
- 註3:培養箱底層應放置水盤,或將培養皿放置於密閉容器中培養,以避免培養前後培養基之水份散失超過 15 %。
- 註4:本文引用之公告方法名稱及編碼,以環保署最新公告者為準。
相關產品:
以上公告來自:中華民國行政院環境保護署(環境檢驗所) https://www.niea.gov.tw