中華民國 102 年 4 月 16 日環署檢字第 1020030307 號公告_自中華民國 102 年 6 月 15 日生效_NIEA E203.56B
【一、方法概要】
本方法係用以檢測能在胰化蛋白腖葡萄糖抽出物培養基（Tryptone glucose extract agar; TGEA）或在培養皿計數培養基（Plate count agar; PCA）中生長並形成菌落之水中好氧及兼性厭氧異營菌。
【二、適用範圍】
本方法適用於飲用水及地面水體、地下水體、廢水、污水、放流水之總菌落數檢驗。
【三、干擾】
（一） 水樣中含有抑制或促進細菌生長物質。
（二） 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌生長物質。
【四、設備及材料】
（一） 量筒：100 至 1000 mL 之量筒。
（二） 吸管：有 0.1 mL 刻度之 1 及 10 mL 無菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管，或無菌微量吸管（Micropipet）。
（三） 培養皿：大小約 90 × 15 mm 之無菌玻璃培養皿或無菌塑膠培養皿。
（四） 稀釋瓶：100 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。
（五） 錐形瓶：200 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。
（六） 採樣容器：容量 120 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠有蓋容器，或市售無菌袋。
（七） 冰箱：溫度能保持在 4 ± 2℃。
（八） 水浴槽：溫度能保持在約 50℃。 第 1 頁，共 8 頁
（九） 培養箱：溫度能保持在 35 ± 1℃。
（十） 高壓滅菌釜：溫度能保持在 121℃（壓力約 15 lb/in2或1.05 kg/cm2）滅菌 15 分鐘以上。
（十一）高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在170 ± 10℃ 達 2 小時以上。
（十二）菌落計數器：用於菌落之計算。
（十三）彎曲玻棒：直徑約 3 至 4 mm，其形狀與規格如圖1所示。
（十四）天平：待測物重量大於 2 g 時，須能精秤至 0.01 g；待測物重量不大於 2 g 時，須能精秤至 0.001 g。
（十五）無菌操作檯：正壓式無菌操作檯或垂直循環負壓式無菌操作檯（Class II 生物安全櫃）。
（十六）pH 計：精確度達 0.1 pH 單位。用於內含瓊脂培養基之 pH 值測定時，應搭配表面電極（Surface probe）。
【五、試劑】
本方法所使用的化學藥品須為試藥級以上，培養基為微生物級製品。
（一） 試劑水：導電度在 25℃ 時小於 2 μmho/cm（μS/cm）。
（二） 培養基：可選取下列二者之一。依下列配方配製培養基，或使用市售商品化的培養基均可。
- 胰化蛋白腖葡萄糖抽出物培養基（Tryptone glucose extract agar; TGEA）
葡萄糖（Glucose） 1.0 g
胰化蛋白腖（Tryptone） 5.0 g
牛肉抽出物（Beef extract） 3.0 g
瓊脂（Agar） 12.0 g 至 15.0 g
試劑水 1 L
經 121℃ 滅菌 15 分鐘後，冷卻至約 50℃，於無菌操作檯內分裝至無菌培養皿中，使培養基厚度約 2 至 4 mm，室溫下凝固。製備之培養基保存於 4 ± 2℃，保存期限為 14 天。 - 培養皿計數培養基（Plate count agar; PCA）
葡萄糖（Glucose） 1.0 g
胰化蛋白腖（Tryptone） 5.0g
酵母抽出物（Yeast extract） 2.5 g
瓊脂（Agar） 15.0 g
試劑水 1 L
經 121℃ 滅菌 15 分鐘後，冷卻至約 50℃，於無菌操作檯內分裝至無菌培養皿中，使培養基厚度約 2 至 4 mm，室溫下凝固。製備之培養基保存於 4 ± 2℃，保存期限為 14 天。可根據檢驗需求量，依配方比例配製培養基。
（三）無菌稀釋液
- 磷酸二氫鉀儲備溶液
取 3.4 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶於 50 mL 之試劑水中，俟完全溶解後，以 1 N 氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 7.2 ± 0.1。然後加試劑水至全量為 100 mL，滅菌（過濾滅菌或 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上）後，儲存於冰箱中備用。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月（註 1）。可根據檢測需求量，依比例配製。 - 氯化鎂儲備溶液
取 8.1 g 六水氯化鎂（MgCl2·6H2O）或 3.8 g 無水氯化鎂，先溶於少量試劑水中，俟完全溶解後，再加試劑水至全量為 100 mL，滅菌（過濾滅菌或 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上）後，儲存於冰箱中備用。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月（註 1）。可根據檢測需求量，依比例配製。 - 無菌稀釋液
分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀儲備溶液，加入試劑水至全量為 2000 mL，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中，經 121℃ 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上，作為無菌稀釋液備用。如欲用於水樣稀釋，分裝之無菌稀釋液滅菌後體積須為 90 ± 2.0 mL。4 ± 2℃ 下保存期限為 6 個月（註 1）。可根據檢測需求量，依比例配製。
【六、採樣與保存】
（一） 盛裝水樣檢驗微生物時，應使用清潔並經滅菌之玻璃瓶、無菌塑膠容器或市售無菌採樣袋，且於採樣時應避免受到污染。水樣若含有餘氯時，應使用內含硫代硫酸鈉錠劑之無菌採樣袋，或於無菌容器中加入適量之無菌硫代硫酸鈉以中和餘氯（採取加氯之廢水時，每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10% 硫代硫酸鈉，可中和之餘氯量約為 15 mg/L。採取含氯之飲用水水樣時，每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 3% 硫代硫酸鈉，可中和之餘氯量約為 5 mg/L）。
（二） 飲用水採樣前應清潔手部，出水口以火烤或以 70% 至 75% 酒精消毒。所採水樣應具有代表性。
（三） 運送時水樣溫度應維持在小於 10℃ 且不得凍結，實驗室內保存溫度應維持在 4 ± 2℃。
（四） 水樣應於採樣後 24 小時內完成水樣塗抹步驟（七、步驟（四）），並置入培養箱中培養。
（五） 水樣量以能做完所需檢驗為度，但不得少於 100 mL。
【七、步驟】
（一） 水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上，以使樣品充分混搖均勻。
（二） 視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟，使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中形成 10 倍稀釋度之水樣，混合均勻，而後自 10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之 100、1000、10000 倍等稀釋水樣並混搖均勻。進行稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。稀釋方法如圖 2 所示（註 2）。
（三） 以 1 mL 無菌吸管或微量吸管吸取 0.2 mL 的原液及（或）各稀釋度水樣滴在培養基上。原液及（或）各稀釋度水樣均需進行二重複。
（四） 將無菌之彎曲玻棒放在培養基上，再用手或旋轉桌（Turn table）旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面、完全被培養基吸收為止。原液及各稀釋度水樣均需更換無菌之彎曲玻棒。
（五） 倒置培養皿於培養箱內，在 35 ± 1℃ 培養 48 ± 3 小時（註 3）。 第 4 頁，共 8 頁
（六） 計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之，若菌落太多造成計數困難，則以「菌落太多無法計數」（Too numerous to count; TNTC）表示。但若各稀釋度培養皿之菌落數均超過 300 個，則不可記錄「菌落太多無法計數」，應選取最接近 300 個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿進行菌落計數。
（七） 步驟（二）至（四）須在無菌操作檯內操作。
【八、結果處理】
（一） 若原液及各稀釋水樣中，僅有一個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 30 至 300 個之間，則選取該稀釋度之兩個培養皿，以下列公式計算總菌落數，單位為 CFU/mL（Colony forming units/mL）：
- 總菌落數（CFU/mL）=選取培養皿之菌落數總和 / 選取培養皿之水樣實際體積總和
- 註：D：選取培養皿之稀釋度
X、Y：D稀釋度的兩個培養皿之菌落數
（二） 若結果與八、（一）所述不符，則以下列方式計算總菌落數：
- 若原液及各稀釋水樣中，僅有一個稀釋度的一個培養皿之菌落數在 30 至 300 個之間，則選取該稀釋度之兩個培養皿，以上述八、（一）公式計算。
- 若原液培養皿中均無菌落生長，則總菌落數以「＜5 CFU/mL」表示。若各培養皿之菌落數均小於 30 個，則選取菌落數最接近 30 個之同一稀釋度的兩個培養皿，以上述八、（一）公式計算。
- 若各培養皿之菌落數均不在 30 至 300 個之間，則選取菌落數最接近 300 個之同一稀釋度的兩個培養皿，以上述八、（一）公式計算。
- 若有兩個稀釋度的二重複培養皿之菌落數均在 30 至 300 個之間，或兩個稀釋度各有 1 個培養皿之菌落數在 30 至 300 個之間，則選取兩個稀釋度共 4 個培養皿，以下列公式計算：
- 總菌落數（CFU/mL）＝ 選取培養皿之菌落數總和 / 選取培養皿之水樣實際體積總和
＝ X1＋Y1＋X2＋Y2 / (0.2 / D1)＋(0.2 / D1)＋(0.2 / D2)＋(0.2 / D2) - 註：D1、D2：選取培養皿之稀釋度
X1、Y1：D1稀釋度的兩個培養皿之菌落數
X2、Y2：D2稀釋度的兩個培養皿之菌落數
（三） 數據表示：若計算所得之總菌落數小於 5（含 0），以「＜5 CFU/mL」表示；總菌落數小於 100 時，以整數表示（小數位數四捨五入），總菌落數為 100 以上時，只取兩位有效數字（四捨五入）。
（四） 檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度的原始數據等相關資料。
【九、品質管制】
（一） 微生物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
（二） 每批次採樣時，應進行運送空白。
（三） 每10個樣品應執行1個方法空白樣品分析，若每批次樣品數少於10個，則每批次仍應執行1個方法空白樣品分析。
（四） 用於結果計算之二重複數據，其對數差異值不可超出精密度管制參考範圍（計算方式參考「環境微生物檢測通則—細菌（NIEA E101）」），除非二重複之菌落數均小於 20。
（五） 新購入之培養基，每批號均須進行培養基品質測試（測試方式詳見「環境微生物檢測通則—細菌（NIEA E101）」）。
（六） 本方法培養所得之細菌可能具有感染性，檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理。
【十、精密度及準確度】
略
【十一、參考資料】
American Public Health Association, American Water Works Association & Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd ed., Method 9215C, APHA, Washington, D. C., USA, 2012.
註1：溶液如出現異物或混濁，則不可繼續使用。
註2：水樣如須稀釋，建議於稀釋後30分鐘內完成檢測步驟，以免造成細菌死亡或增生，影響實驗結果。
註3：培養箱底層應放置水盤，或將培養皿放置於密閉容器中培養，以避免培養前後培養基之水份散失超過 15%。
註4：本文引用之公告方法名稱及編碼，以環保署最新公告者為準。
相關產品：
以上公告來自：中華民國行政院環境保護署（環境檢驗所） https://www.niea.gov.tw
